Diabetologia：激活但功能受损的记忆Tregs在1同型糖尿病患者进展缓慢的过程中逐渐扩展

从第一次显现成去甲自身抗原到显现成1同型肝炎临床研究病征的的发展不下在幼儿时期就有很好的描绘成，多个去甲自身抗原特征性的幼儿中所有70%在血清转换后10年内患上肝炎，而随访15年的幼儿这一数量增大到84%。相对之下，占临床研究1同型肝炎一半以上的同型1同型肝炎的胃癌组态还无法得到充份的统计分析。

越来越多的人开始适用分期管理系统来定义1同型肝炎的的发展：变异在显现成多种去甲自身抗原时离开第1过渡阶段，显现成血糖精神状态时离开第2过渡阶段，显现成病征时离开第3过渡阶段。一些多发去甲自身抗原特征性的变异，在1期和2期，的发展较很慢，并发展为胃癌的1同型肝炎。我们在此之前描绘成了举例来说成员在首次样品到多种去甲自身抗原检验后至想像中多10年无肝炎的想像中很慢的发展者，这组成员病患者人数想像中多，但特征非常明确。随后，我们见到去甲自身抗原特异性CD8+T细胞内中间体在的发展较很慢的病患者中所基本不发挥作用，但在近期胃癌和长期以来发挥作用的肝炎病患者中所很容易样品到。这可能说明了，与的发展病患者相对，这些病患者自身免疫中间体的可调增强。

早期统计分析说明了，尽管可调性T细胞内(Treg)数量正常，但肝炎病患者发挥作用一些功能缺陷，其中所以外对IL-2的中间体并能降低。此外，肝炎病患者中所的现像CD4+T细胞内可能对可调不具抵抗性，显出为现像T细胞内的诱发减弱，自然产生的Treg和棒状外产生的作用于Treg，以及抗原经历的CD4+T细胞内中所IL-2中间体减弱。本统计分析的目的是描绘成了CD4+可调性T细胞内(Treg)在群集想像中较很慢的发展者中所的特征，他们的岁数为43岁(31-72岁)，随访时间为18-32年。

工具：BOX统计分析是一项以人群蓝本的纵向统计分析，在21岁请注意确诊的病患者家庭成员中所检查1同型肝炎的生命危险因素。我们在此之前描绘成了长期以来较很慢的发展者的特征，他们维持多重去甲自身抗原特征性超过10年，但无法显现成肝炎的临床研究病征，很慢性或非顺利完成性自身免疫。随后，10名之后维持无肝炎并愿意提供大量血清检验的较很慢的发展者引入到T和B细胞内功能统计分析。在在此之前的统计分析中所，8名很慢的发展者(SP组成员)，中所位年龄43岁(31-72岁)，18 - 32岁彼此间的去甲自身抗原特征性。所有的大多数人都东南面1同型肝炎的发展的1期，尽管一些人随后得不到了去甲自身抗原对某些抗原的深红色，然而，一名病患者已经东南面2期至想像中多6年，但无法显现成临床研究病征，一名病患者被病人为肝炎，该病患72岁，在搜集实验检验时，其HbA1c上升时到53 mmol/mol(7%)，在科研人员中所对该供棒状顺利完成了之外审计。复合外周血单个核子细胞内(PBMCs)，运用于多参数流式细胞内妖术和T细胞内诱发试验审计供棒状中所Treg的频谱、表同型和功能。适用FlowSOM和CITRUS(聚类检验、表征和回归)顺利完成无监督聚类统计分析，审计Treg表同型。

结果：与保健供棒状相对，来自很慢的发展棒状的知觉CD4+T细胞内的监督聚类结果显示，激活的知觉CD4+ Treg频谱增大，与糖皮质激素作用于的TNFR无关蛋白(GITR)理解增大有关。一名HbA1c上升时的病患者与的发展较很慢者和匹配的依此组成员相对，Treg谱有所各不相同。功能统计分析说明了，与保健供棒状相对，来自较很慢的发展棒状的Treg作用于的CD4+现像T细胞内诱发明显损毁。显出为对现像CD4+T细胞内CD25和CD134理解的诱发增大。

平面图1 深入的表同型统计分析结果显示，CD4+Treg亚同型在很慢的发展队列中所增大。由FlowSOM生成的Treg二楼，群聚在来自所有供棒状的活CD4+CD45RA -细胞内上。根据上标物理解检验成10个元簇:知觉T细胞内_1;知觉T cell_2;知觉T cell_3;知觉T cell_4;CD49b知觉T细胞内;HLA-DR + GITR +知觉T细胞内;缓存Treg_1;缓存Treg_2;缓存Treg_3;和缓存Treg_4。(a)适用9个各不相同Treg上标生成的10个元簇的MST。每个数据流代表一个坦克部队(100个坦克部队)，更为大的元坦克部队(10个元坦克部队)在数据流组成员周围成品。每个数据流中所的饼平面图指出单个上标的理解等级。(b)每个元聚类的热平面图，以结果显示全面性上标理解。(c, d)为HD组成员(c)和SP组成员(d)生成平面图，以及FlowSOM标记的每个元簇的覆盖层。(e-l)比较轻元素为每个metacluster筒线或平面图(轻元素> 0.05%)确切为HD和SP组成员:缓存Treg_2 (e),缓存Treg_3 (f),缓存Treg_4 (g), HLA-DR + GITR +知觉T细胞内(h)、知觉T cell_1(i),知觉T cell_2 (j),知觉T cell_3 (k) n d CD49b知觉T细胞内(l)。粉红色边框代表捐**SP 606。**p< 0.01, Wilcoxon相加大写字母秩检验。此键适用于平面图形部分(a)， (c)， (d)和d (e-l)

平面图2 适用CITRUS的数据统计分析表明，Treg频谱的增大是的发展较很慢的标识。分级制度相关联(a - f)和柑橘统计分析(g-k)比较SP大多数人和匹配的HD大多数人在CD4+CD45RA−T细胞内上的差异。(a)表同型CD25+ cd127 lotreg和CD25loCD127+T c e l小团棒状的代表性平面图。CD25+ cd127lotreg被CD39和FOXP3富集，然后通过HLA-DR和GITR理解顺利完成复合，模拟FlowSOM小团棒状。(b) HD(黑点)和SP(黑纹)组成员以及供棒状SP 606(粉红色)中所CD25+ cd127的频谱汇总平面图。(c-f) CD25+CD127loCD39+FOXP3+和CD25loCD127+相关联子集的筒线或平面图;(c) HLA-DRloGITR−(缓存Treg_2)， (d) HLA-DRintGITRlo(缓存Treg_3)， (e) HLA- d RhiGITR+(缓存Treg_4)， (f) HLA- d RhiGITR+(HLA-DR+GITR+缓存T cell)。(g - i)果树簇臂由(g) CD127， (h) CD25和(i) FOXP3理解强度着色，箭头显眼的簇被标记为SP和HD队列彼此间的各不相同。(j)筒线或平面图结果显示了在SP(黑纹)和HD(灰点)组成员中所，CITRUS知觉Treg_3和Treg_4的比较轻元素(数量)。(k)直方平面图结果显示每个簇的表同型(紫色)和Treg上标比较理解与着重理解(蓝色);上列，缓存Treg_3;下面一行，缓存Treg_4。着重与所有其他簇中所上标的理解有关。*p< 0.05， **p< 0.01, Wilcoxon相加大写字母秩检验

平面图3 与保健献血者相对，的发展较很慢者知觉treg的GITR增大。每个知觉CD4+T细胞内元簇(知觉T细胞内_1;知觉T cell_2;知觉T cell_3;CD49b +知觉T细胞内;HLA-DR + GITR +知觉T细胞内;缓存Treg_2;缓存Treg_3;来自FlowSOM的memory Treg_4)样品每个理解上标的发生变化。(a,b)来自HD (a)和S (b)队列的理解热平面图(sp606不以外在内)。(c,d)知觉Treg_4元簇中所所有HD(灰色)、所有SP(蓝色)和SP 606(粉红色)的FlowSOM GITR理解结合，结果显示直方平面图(c)和汇总平面图(d)。Wilcoxon相加大写字母秩和检验，p< 0.07(粉红色)所有供棒状以外，p< 0.05(蓝色)供棒状SP 606和匹配的HD不以外在测试中所。(e,f) HLA-DRhiGITR+Tregs中所GITR理解，从分级制度相关联，从所有HD(灰色)、所有SP(蓝色)和SP 606(粉红色)结合，结果显示直方平面图(e)和汇总平面图(f) *p< 0.05, Wilcoxon相加大写字母秩检验

平面图4 来自较很慢的发展的CD4+ treg细胞内操纵现像CD4+T细胞内的并能降低。SP组成员用蓝色的线或和边框指出，HD组成员用粉红色的线或和边框指出，粉红色的线或/边框指出供棒状sp606。适用CD4+CD25+ Treg分选试剂盒对CD4+T细胞内顺利完成分选。CD4+CD25−(转发者)被上标为CFSE, Treg按观察的数量试样。用抗CD3 /28微珠再造细胞内，培养3天后顺利完成流式细胞内妖术样品。(a-d)与CD4+转发者比较应的treg培养(自棒状)(e-h) HD、SP或SP 606 Treg与HD转发者培养。(a,b,f) CFSE再生(a,e)和CFSE诱发总和(b,f)。(c, d,h) CD25 (c,g)和CD134 (d,h)的诱发总和。适用特征性依此(激活的自发细胞内不含treg)计算诱发总和。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001，重复测量双向方差统计分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比较测试

平面图5 现像CD4+T细胞内对较很慢的发展的T细胞内再造的诱发更为敏感。SP组成员用蓝色的线或和边框指出，HD组成员用粉红色的线或和边框指出，粉红色的线或/边框指出供棒状sp606。适用CD4+CD25+Treg分选试剂盒对CD4+T细胞内顺利完成分选。CD4+CD25−(转发者)被cfsel上标，treg按观察的数量试样。用抗CD3 /28微珠再造细胞内，培养3天后顺利完成流式细胞内妖术(CD25反染)和细胞内因子统计分析。HD Treg与HD、SP或sp606转发者共同培养。(a,b) CFSE再生(a)和CFSE诱发百分不下(b)。(c,d) CD25诱发百分不下(c)和CD134诱发百分不下(d)。(e,f) IFN-γ(e)和IL-17A (f)在培养成来中所的理解。***p< 0.001， **p< 0.01，重复测量双向方差统计分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重比较测试

结论：我们得成的结论是，来自较很慢的发展子的再造知觉CD4+Treg在GITR理解中所得到了引入和丰富，重申了进一步统计分析Treg在1同型肝炎生命危险性变异中所的异质性的必要性。

原意成处：

Boldison J, Long AE, Aitken RJ,et al.Activated but functionally impaired memory Tregs are expanded in slow progressors to type 1 diabetes.Diabetologia 2021 Oct 28